Molekularbiologie -
Molecular biology

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Synthese, Modifikation, Mechanismen und Wechselwirkungen. Die Untersuchung der chemischen und physikalischen Struktur biologischer Makromoleküle wird als Molekularbiologie bezeichnet.

Molekularbiologie wurde zuerst als ein Ansatz beschrieben, der sich auf die Grundlagen biologischer Phänomene konzentriert – die Aufdeckung der Strukturen biologischer Moleküle sowie ihrer Wechselwirkungen und wie diese Wechselwirkungen Beobachtungen der klassischen Biologie erklären.

1945 wurde der Begriff Molekularbiologie vom Physiker William Astbury verwendet. Die Entwicklung auf dem Gebiet der Molekularbiologie erfolgte sehr spät, um zu verstehen, dass das komplexe System oder der vorteilhafte Ansatz auf einfache Weise zu verstehen wäre, indem Bakterien und Bakteriophagen verwendet werden, die Informationen über grundlegende biologische Prozesse leichter liefern als tierische Zellen. Im Jahr 1953 stellten zwei junge Männer namens Francis Crick und James Watson, die in der Abteilung des Medical Research Council, Cavendish Laboratory, Cambridge (heute MRC Laboratory of Molecular Biology ) arbeiteten, ein Doppelhelix-DNA-Modell her, das das gesamte von ihnen vorgeschlagene Forschungsszenario der DNA veränderte Struktur basierend auf früheren Forschungen von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins, dann führte die Forschung zum Auffinden von DNA-Material in anderen Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren.

Molekularbiologie ist nicht einfach das Studium biologischer Moleküle und ihrer Wechselwirkungen; Vielmehr ist es auch eine Sammlung von Techniken, die seit der Entstehung des Fachgebiets entwickelt wurden und es Wissenschaftlern ermöglicht haben, etwas über molekulare Prozesse zu lernen. Eine bemerkenswerte Technik, die das Gebiet revolutioniert hat, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 1983 entwickelt wurde. PCR ist eine Reaktion, die kleine DNA-Mengen amplifiziert, und sie wird in vielen Anwendungen in allen wissenschaftlichen Disziplinen verwendet, wie später diskutiert wird .

Das zentrale Dogma der Molekularbiologie beschreibt den Prozess, bei dem DNA in RNA umgeschrieben wird, die dann in Protein übersetzt wird.

bezeichnet wird .

Geschichte der Molekularbiologie

Molekularbiologie sitzt an der Schnittstelle von Biochemie und Genetik; Als diese wissenschaftlichen Disziplinen im 20. Jahrhundert auftauchten und sich weiterentwickelten, wurde klar, dass sie beide versuchten, die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die den lebenswichtigen Zellfunktionen zugrunde liegen. Fortschritte in der Molekularbiologie sind eng mit der Entwicklung neuer Technologien und ihrer Optimierung verbunden. Die Molekularbiologie wurde durch die Arbeit vieler Wissenschaftler aufgeklärt, und daher hängt die Geschichte des Gebiets vom Verständnis dieser Wissenschaftler und ihrer Experimente ab.

Alles beginnt mit dem Phänomen der Transformation in den Bakterien. 1928 beobachtete Frederick Griffith ein Phänomen der Transformation von einem Bakterium zum anderen [heute bekannt als genetische Transformation]. Damals konnte er das Phänomen der Transformation nicht erklären. Später im Jahr 1944 demonstrierten die drei Wissenschaftler Oswald Avery, Colin Macleod und Maclyn McCarty das ganze Phänomen der Transformation in Bakterien. Nach zwei Jahren im Jahr 1930 wurde die Molekularbiologie als offizieller Wissenschaftszweig etabliert. Aber der Begriff „Molekularbiologie“ wurde erst 1938 geprägt, und zwar von dem Wissenschaftler Warren Weaver, der als Direktor für Naturwissenschaften bei der Rockefeller Foundation arbeitete.

Aus dem folgenden Experiment wurde geschlossen, dass DNA das grundlegende genetische Material ist, das die genetischen Veränderungen verursacht hat. Die grundlegende Zusammensetzung der DNA war bekannt, dass sie vier Basen enthält, die als Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin bekannt sind. Auf der Grundlage der chemischen Zusammensetzung und der Röntgenkristallographie von Maurice Wilkins und Rosalind Franklin wurde die DNA-Struktur von James Watson und Francis Crick vorgeschlagen. Aber bevor Watson und Crick die DNA-Struktur vorschlugen, schlug der in Österreich geborene Wissenschaftler Erwin Chargaff 1950 die Theorie/Regel [heute als Chargaff-Regel bekannt] vor, die besagt, dass die Anzahl von Adenin und Thymin und Guanin und Cytosin gleich ist Anteil.

Die Regel des Chargaff

„Chargaffs Regel besagte, dass DNA von jeder Art von jedem Organismus ein stöchiometrisches Verhältnis von 1:1 von Purin und Pyrimidinen (dh A + G = T + C) haben sollte und, genauer gesagt, dass die Menge an Guanin gleich Cytosin sein sollte und die Menge an Adenin sollte gleich der von Thymin sein . Dieses Muster findet sich in beiden Strängen der DNA".

Das Gebiet der Genetik entstand aus dem Versuch, die molekularen Mechanismen der genetischen Vererbung und die Struktur eines Gens zu verstehen . Gregor Mendel bereitete diese Arbeit 1866 vor, als er zum ersten Mal die Gesetze der genetischen Vererbung auf der Grundlage seiner Studien über Paarungskreuzungen in Erbsenpflanzen schrieb. Ein solches Gesetz der genetischen Vererbung ist das Gesetz der Segregation , das besagt, dass diploide Individuen mit zwei Allelen für ein bestimmtes Gen eines dieser Allele an ihre Nachkommen weitergeben. Aufgrund seiner kritischen Arbeit wird das Studium der genetischen Vererbung allgemein als Mendelsche Genetik bezeichnet .

Ein wichtiger Meilenstein in der Molekularbiologie war die Entdeckung der DNA-Struktur. Diese Arbeit begann 1869 von Friedrich Miescher , einem Schweizer Biochemiker, der als erster eine Struktur namens Nuclein vorschlug , die wir heute als Desoxyribonukleinsäure oder DNA kennen. Er entdeckte diese einzigartige Substanz, indem er die Bestandteile von mit Eiter gefüllten Verbänden untersuchte und die einzigartigen Eigenschaften der "phosphorhaltigen Substanzen" feststellte. Ein weiterer bemerkenswerter Beitrag zum DNA-Modell war Phoebus Levene , der 1919 als Ergebnis seiner biochemischen Experimente an Hefe das "Polynukleotid-Modell" der DNA vorschlug. 1950 erweiterte Erwin Chargaff die Arbeit von Levene und erläuterte einige kritische Eigenschaften von Nukleinsäuren: Erstens variiert die Sequenz von Nukleinsäuren zwischen den Arten. Zweitens ist die Gesamtkonzentration an Purinen (Adenin und Guanin) immer gleich der Gesamtkonzentration an Pyrimidinen (Cystein und Thymin). Dies ist heute als Chargaff-Regel bekannt. 1953 veröffentlichten James Watson und Francis Crick die Doppelhelixstruktur der DNA unter Verwendung der Röntgenkristallographie- Arbeit von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins . Watson und Crick beschrieben die Struktur der DNA und vermuteten die Auswirkungen dieser einzigartigen Struktur auf mögliche Mechanismen der DNA-Replikation.

JD Watson und FHC Crick wurden 1962 zusammen mit Maurice Wilkens für den Vorschlag eines Modells der DNA-Struktur mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

Im Laufe der Zeit entdeckten KA Marcker und Frederick Sanger 1964 eine besondere Amioacyl-tRNA in E. coli, genannt N-Formyl-Methionyl – tRNA, und erklärten, dass dieses Molekül eine Rolle bei einem speziellen Mechanismus der Kettenverlängerung spielt. Er erhielt den zweiten Nobelpreis für die Entdeckung der vollständigen Sequenz von 5.400 Nukleotiden einzelsträngiger DNA von F ´ 174 Bakteriophagen.

1961 wurde gezeigt, dass, wenn ein Gen ein Protein kodiert , drei aufeinanderfolgende Basen der DNA eines Gens jede aufeinanderfolgende Aminosäure des Proteins spezifizieren. Somit ist der genetische Code ein Triplett-Code, bei dem jedes Triplett (als Codon bezeichnet) eine bestimmte Aminosäure spezifiziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Codons in der DNA-Sequenz, die ein Protein kodiert, nicht miteinander überlappen und dass jede Sequenz von einem festen Startpunkt aus gelesen wird.

In den Jahren 1962–1964 wurden durch die Verwendung bedingter letaler Mutanten eines bakteriellen Virus grundlegende Fortschritte in unserem Verständnis der Funktionen und Wechselwirkungen der Proteine ​​gemacht, die in der Maschinerie der DNA-Replikation , der DNA-Reparatur , der DNA-Rekombination und des Zusammenbaus verwendet werden von molekularen Strukturen.

Schematische Darstellung der DNA-Struktur von Watson und Crick
Winkelbeschreibung in der DNA-Struktur

Das F.Griffith-Experiment

Schematische Darstellung des Experiments

Im Jahr 1928 stieß Fredrick Griffith auf eine Virulenzeigenschaft in Pneumokokkenbakterien, die Laborratten tötete. Laut Mendel konnte der damals vorherrschende Gentransfer nur von Eltern- auf Tochterzellen erfolgen. Griffith stellte eine andere Theorie auf und erklärte, dass der Gentransfer, der bei Mitgliedern derselben Generation auftritt, als horizontaler Gentransfer (HGT) bezeichnet wird. Dieses Phänomen wird heute als genetische Transformation bezeichnet.

Griffith sprach das Bakterium Streptococcus pneumoniae an , das zwei verschiedene Stämme hatte, einen virulenten und glatten und einen avirulenten und rauen. Der glatte Stamm hatte ein glitzerndes Aussehen aufgrund des Vorhandenseins einer Art von spezifischem Polysaccharid – einem Polymer aus Glucose und einer Glucuronsäurekapsel. Aufgrund dieser Polysaccharid-Bakterienschicht kann das Immunsystem eines Wirts die Bakterien nicht erkennen und tötet den Wirt. Dem anderen, avirulenten, rauen Stamm fehlt diese Polysaccharidkapsel und er hat ein stumpfes, raues Aussehen.

Es ist bekannt, dass das Vorhandensein oder Fehlen einer Kapsel in dem Stamm genetisch bedingt ist. Glatte und raue Stämme treten in verschiedenen Typen auf, wie SI, S-II, S-III usw. bzw. RI, R-II, R-III usw. Alle diese Subtypen von S- und R-Bakterien unterscheiden sich im Antigentyp, den sie produzieren.

Hershey und Chase experimentieren

Hershey und Chase experimentieren

Die Bestätigung, dass DNA das genetische Material ist, das die Infektion verursacht, kam aus dem Experiment von Hershey und Chase. Sie verwendeten E.coli und Bakteriophagen für das Experiment. Dieses Experiment ist auch als Mixer-Experiment bekannt, da ein Küchenmixer als Hauptgerät verwendet wurde. Alfred Hershey und Martha Chase zeigten, dass die DNA, die von einem Phagenpartikel in ein Bakterium injiziert wird, alle Informationen enthält, die für die Synthese von Nachkommen-Phagenpartikeln erforderlich sind. Sie nutzten Radioaktivität, um die Proteinhülle des Bakteriophagen mit radioaktivem Schwefel und die DNA mit radioaktivem Phosphor in jeweils zwei verschiedenen Reagenzgläsern zu markieren. Nach dem Mischen von Bakteriophagen und E.coli in das Reagenzglas beginnt die Inkubationszeit, in der der Phagen das Erbgut in den E.coli - Zellen umwandelt. Dann wird die Mischung gemischt oder gerührt, was den Phagen von E. coli- Zellen trennt. Die gesamte Mischung wird zentrifugiert und das Pellet, das E. coli- Zellen enthält, wurde überprüft und der Überstand verworfen. Die E.coli- Zellen zeigten radioaktiven Phosphor, was anzeigte, dass das transformierte Material DNA und nicht die Proteinhülle war.

Die transformierte DNA wird an die DNA von E.coli gebunden und Radioaktivität wird nur auf der DNA des Bakteriophagen sichtbar. Diese mutierte DNA kann an die nächste Generation weitergegeben werden und die Theorie der Transduktion entstand. Transduktion ist ein Prozess, bei dem die bakterielle DNA das Fragment von Bakteriophagen trägt und an die nächste Generation weitergibt. Auch dies ist eine Art horizontaler Gentransfer.

Moderne Molekularbiologie

Gegen Mitte der 20er Jahre tritt die Molekularbiologie in ein goldenes Zeitalter ein, das sowohl von vertikaler als auch horizontaler technischer Entwicklung geprägt ist. Vertikal ermöglichen neuartige Technologien die Echtzeitüberwachung biologischer Prozesse auf atomarer Ebene. Molekularbiologen haben heute Zugang zu immer erschwinglicheren Sequenzierungsdaten in immer größeren Tiefen, was die Entwicklung neuartiger genetischer Manipulationsmethoden in neuen Nicht-Modellorganismen erleichtert. Ebenso werden synthetische Molekularbiologen die industrielle Produktion von kleinen und Makromolekülen durch die Einführung exogener Stoffwechselwege in verschiedene prokaryotische und eukaryotische Zelllinien vorantreiben.

Horizontal werden Sequenzierungsdaten erschwinglicher und in vielen verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen verwendet. Dies wird die Entwicklung von Industrien in Entwicklungsländern vorantreiben und die Zugänglichkeit für einzelne Forscher verbessern. Ebenso können CRISPR-Cas9-Geneditierungsexperimente jetzt von Einzelpersonen für unter 10.000 US-Dollar in neuartigen Organismen konzipiert und implementiert werden, was die Entwicklung industrieller und medizinischer Anwendungen vorantreiben wird

Beziehung zu anderen biologischen Wissenschaften

Schematischer Zusammenhang zwischen Biochemie , Genetik und Molekularbiologie

Die folgende Liste beschreibt einen Standpunkt zu den interdisziplinären Beziehungen zwischen der Molekularbiologie und anderen verwandten Gebieten.

  • Molekularbiologie ist das Studium der molekularen Grundlagen biologischer Phänomene, wobei der Schwerpunkt auf molekularer Synthese, Modifikation, Mechanismen und Wechselwirkungen liegt.
  • Genetik ist die Lehre davon, wie genetische Unterschiede Organismen beeinflussen. Die Genetik versucht vorherzusagen, wie Mutationen , einzelne Gene und genetische Interaktionen die Ausprägung eines Phänotyps beeinflussen können
„von Grund auf“ oder molekular zu untersuchen .

Techniken der Molekularbiologie

DNA-Animation

Molekulares Klonen

Transduktionsbild
, die die Expression des klonierten Gens regulieren.

Dieses Plasmid kann entweder in bakterielle oder tierische Zellen eingeführt werden. Das Einbringen von DNA in Bakterienzellen kann durch Transformation durch Aufnahme nackter DNA, Konjugation durch Zell-Zell-Kontakt oder durch Transduktion über einen viralen Vektor erfolgen. Das Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen, wie tierische Zellen, durch physikalische oder chemische Mittel wird als Transfektion bezeichnet . Es stehen mehrere unterschiedliche Transfektionstechniken zur Verfügung, wie z. B. Calciumphosphat-Transfektion, Elektroporation , Mikroinjektion und Liposomen-Transfektion . Das Plasmid kann in das Genom integriert werden , was zu einer stabilen Transfektion führt, oder kann unabhängig vom Genom bleiben und vorübergehend exprimiert werden, was als transiente Transfektion bezeichnet wird.

DNA, die für ein interessierendes Protein kodiert, befindet sich jetzt in einer Zelle, und das Protein kann nun exprimiert werden. Eine Vielzahl von Systemen, wie z. B. induzierbare Promotoren und spezifische Zellsignalfaktoren, sind verfügbar, um die Expression des interessierenden Proteins in hohen Konzentrationen zu unterstützen. Große Mengen eines Proteins können dann aus der Bakterien- oder Eukaryotenzelle extrahiert werden. Das Protein kann in einer Vielzahl von Situationen auf enzymatische Aktivität getestet werden, das Protein kann kristallisiert werden, damit seine Tertiärstruktur untersucht werden kann, oder in der pharmazeutischen Industrie kann die Aktivität neuer Arzneimittel gegen das Protein untersucht werden.

Polymerase Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine äußerst vielseitige Technik zum Kopieren von DNA. Kurz gesagt ermöglicht die PCR das Kopieren oder Modifizieren einer spezifischen DNA-Sequenz auf vorbestimmte Weise. Die Reaktion ist extrem stark und könnte unter perfekten Bedingungen ein DNA-Molekül in weniger als zwei Stunden zu 1,07 Milliarden Molekülen amplifizieren. PCR hat viele Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Genexpression, des Nachweises pathogener Mikroorganismen, des Nachweises genetischer Mutationen und der Einführung von Mutationen in die DNA. Die PCR-Technik kann verwendet werden, um Restriktionsenzymstellen an Enden von DNA-Molekülen einzuführen oder um bestimmte DNA-Basen zu mutieren, letzteres ist ein Verfahren, das als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet wird . PCR kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob ein bestimmtes DNA-Fragment in einer cDNA-Bibliothek gefunden wird . PCR hat viele Variationen, wie Reverse-Transkriptions-PCR ( RT-PCR ) zur Amplifikation von RNA und in jüngerer Zeit quantitative PCR , die eine quantitative Messung von DNA- oder RNA-Molekülen ermöglicht.

Zweiprozentiges Agarosegel in Boratpuffer, gegossen in eine Gelschale.

Gelelektrophorese

SDS-SEITE

Gelelektrophorese ist eine Technik, die Moleküle anhand ihrer Größe unter Verwendung eines Agarose- oder Polyacrylamidgels trennt. Diese Technik ist eines der wichtigsten Werkzeuge der Molekularbiologie. Das Grundprinzip ist, dass DNA-Fragmente durch Anlegen eines elektrischen Stroms über das Gel getrennt werden können – da das DNA-Rückgrat negativ geladene Phosphatgruppen enthält, wandert die DNA durch das Agarosegel zum positiven Ende des Stroms. Proteine ​​können auch nach Größe mit einem SDS-PAGE- Gel oder nach Größe und ihrer elektrischen Ladung mit einer sogenannten 2D-Gelelektrophorese getrennt werden .

Auf einem PAGE-Gel mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbte Proteine.

Der Bradford-Assay

Der Bradford-Assay ist eine molekularbiologische Technik, die die schnelle und genaue Quantifizierung von Proteinmolekülen ermöglicht, indem die einzigartigen Eigenschaften eines Farbstoffs namens Coomassie Brilliant Blue G-250 genutzt werden. Coomassie Blue erfährt bei Bindung an Protein eine sichtbare Farbverschiebung von Rotbraun zu Hellblau. In seinem instabilen, kationischen Zustand hat Coomassie Blue eine Hintergrundwellenlänge von 465 nm und gibt eine rotbraune Farbe ab. Wenn Coomassie Blue in einer sauren Lösung an Protein bindet, verschiebt sich die Hintergrundwellenlänge auf 595 nm und der Farbstoff gibt eine hellblaue Farbe ab. Proteine ​​im Assay binden Coomassie-Blau in etwa 2 Minuten, und der Protein-Farbstoff-Komplex ist etwa eine Stunde lang stabil, obwohl empfohlen wird, Absorptionsmessungen innerhalb von 5 bis 20 Minuten nach Beginn der Reaktion durchzuführen. Die Proteinkonzentration im Bradford-Assay kann dann unter Verwendung eines Spektrophotometers für sichtbares Licht gemessen werden und erfordert daher keine umfangreiche Ausrüstung.

Diese Methode wurde 1975 von Marion M. Bradford entwickelt und hat im Vergleich zu früheren Methoden, dem Lowry-Verfahren und dem Biuret-Assay, eine wesentlich schnellere und genauere Proteinquantifizierung ermöglicht. Im Gegensatz zu den vorherigen Methoden ist der Bradford-Assay nicht anfällig für Störungen durch mehrere Nicht-Protein-Moleküle, einschließlich Ethanol, Natriumchlorid und Magnesiumchlorid. Es ist jedoch anfällig für den Einfluss starker alkalischer Puffermittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS).

Blotting und Sondierung von Makromolekülen

bekannt wurde, benutzte den Begriff eigentlich nicht.

Southern-Blotting

Benannt nach seinem Erfinder, dem Biologen Edwin Southern , ist der Southern Blot eine Methode zur Untersuchung auf das Vorhandensein einer spezifischen DNA-Sequenz in einer DNA-Probe. DNA-Proben vor oder nach dem Verdau mit Restriktionsenzymen (Restriktionsendonuclease) werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt und dann durch Blotting über Kapillarwirkung auf eine Membran übertragen . Die Membran wird dann einer markierten DNA-Sonde ausgesetzt, die eine komplementäre Basensequenz zu der Sequenz auf der interessierenden DNA aufweist. Southern Blotting wird in der Laborwissenschaft weniger häufig verwendet, da andere Techniken wie PCR , spezifische DNA-Sequenzen aus DNA-Proben nachweisen können. Diese Blots werden jedoch immer noch für einige Anwendungen verwendet, z. B. zur Messung der transgenen Kopienzahl in transgenen Mäusen oder bei der Entwicklung von embryonalen Gen-Knockout -Stammzelllinien .

Northern-Blotting

Northern-Blot-Diagramm

Der Northern Blot wird verwendet, um das Vorhandensein spezifischer RNA-Moleküle als relativen Vergleich zwischen einer Reihe verschiedener RNA-Proben zu untersuchen. Es ist im Wesentlichen eine Kombination aus denaturierender RNA-Gelelektrophorese und einem Blot . In diesem Prozess wird die RNA nach Größe getrennt und dann auf eine Membran übertragen, die dann mit einem markierten Komplement einer interessierenden Sequenz sondiert wird. Die Ergebnisse können je nach verwendetem Etikett auf verschiedene Weise visualisiert werden; die meisten führen jedoch zur Aufdeckung von Banden, die die Größe der in der Probe nachgewiesenen RNA darstellen. Die Intensität dieser Banden hängt von der Menge der Ziel-RNA in den analysierten Proben ab. Das Verfahren wird üblicherweise verwendet, um zu untersuchen, wann und wie viel Genexpression stattfindet, indem gemessen wird, wie viel dieser RNA in verschiedenen Proben vorhanden ist, unter der Annahme, dass keine posttranskriptionelle Regulation auftritt und dass die mRNA-Spiegel proportionale Spiegel des entsprechenden Proteins widerspiegeln produziert. Es ist eines der grundlegendsten Werkzeuge, um zu bestimmen, wann und unter welchen Bedingungen bestimmte Gene in lebenden Geweben exprimiert werden.

Western-Blotting

direkt anzufärben .

Eastern-Blotting

Die Eastern- Blotting - Technik wird verwendet, um posttranslationale Modifikationen von Proteinen nachzuweisen. Auf die PVDF- oder Nitrozellulosemembran geblottete Proteine ​​werden unter Verwendung spezifischer Substrate auf Modifikationen untersucht.

Mikroarrays

Ein DNA-Microarray wird gedruckt
Hybridisierung von Ziel zu Sonde

Ein DNA-Mikroarray ist eine Ansammlung von Spots, die an einem festen Träger wie einem Mikroskop-Objektträger befestigt sind, wobei jeder Spot ein oder mehrere einzelsträngige DNA- Oligonukleotidfragmente enthält . Arrays ermöglichen es, große Mengen sehr kleiner (100 Mikrometer Durchmesser) Spots auf einem einzigen Objektträger abzulegen. Jeder Fleck hat ein DNA-Fragmentmolekül, das zu einer einzelnen DNA-Sequenz komplementär ist . Eine Variante dieser Technik erlaubt es, die Genexpression eines Organismus in einem bestimmten Entwicklungsstadium zu qualifizieren ( Expression Profiling ). Bei dieser Technik wird die RNA in einem Gewebe isoliert und in markierte komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Diese cDNA wird dann mit den Fragmenten auf dem Array hybridisiert und die Hybridisierung kann sichtbar gemacht werden. Da mehrere Arrays mit genau der gleichen Position von Fragmenten hergestellt werden können, sind sie besonders nützlich für den Vergleich der Genexpression von zwei verschiedenen Geweben, wie z. B. einem gesunden und einem krebsartigen Gewebe. Außerdem kann man messen, welche Gene exprimiert werden und wie sich diese Expression mit der Zeit oder mit anderen Faktoren ändert. Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, Mikroarrays herzustellen; Am gebräuchlichsten sind Siliziumchips, Objektträger mit Spots von ~100 Mikrometer Durchmesser, kundenspezifische Arrays und Arrays mit größeren Spots auf porösen Membranen (Makroarrays). Auf einem bestimmten Array kann es zwischen 100 und mehr als 10.000 Spots geben. Arrays können auch mit anderen Molekülen als DNA hergestellt werden.

Allelspezifisches Oligonukleotid

Allelspezifisches Oligonukleotid (ASO) ist eine Technik, die den Nachweis von Einzelbasenmutationen ohne die Notwendigkeit einer PCR oder Gelelektrophorese ermöglicht. Kurze (20–25 Nukleotide lange), markierte Sonden werden der nicht fragmentierten Ziel-DNA ausgesetzt, die Hybridisierung erfolgt aufgrund der kurzen Länge der Sonden mit hoher Spezifität, und selbst eine einzige Basenänderung behindert die Hybridisierung. Die Ziel-DNA wird dann gewaschen und die markierten Sonden, die nicht hybridisiert haben, werden entfernt. Die Ziel-DNA wird dann mittels Radioaktivität oder Fluoreszenz auf das Vorhandensein der Sonde analysiert. Bei diesem Experiment muss, wie bei den meisten molekularbiologischen Techniken, eine Kontrolle verwendet werden, um ein erfolgreiches Experiment sicherzustellen.

In der Molekularbiologie werden Verfahren und Technologien ständig weiterentwickelt und ältere Technologien aufgegeben. Zum Beispiel wurde vor dem Aufkommen der DNA -Gelelektrophorese ( Agarose oder Polyacrylamid ) die Größe von DNA-Molekülen typischerweise durch Geschwindigkeitssedimentation in Saccharosegradienten bestimmt , eine langsame und arbeitsintensive Technik, die teure Instrumente erfordert; vor Saccharosegradienten wurde Viskosimetrie verwendet. Abgesehen von ihrem historischen Interesse ist es oft wert, etwas über ältere Technologien zu wissen, da es gelegentlich nützlich ist, ein anderes neues Problem zu lösen, für das die neuere Technik nicht geeignet ist.

Siehe auch

Verweise

Weiterlesen

  • Rodgers M (Juni 1975). "Kongress der Büchse der Pandora". Rollender Stein . Vol. 189. S. 37–77.
  • Roberts K., Raff M., Alberts B., Walter P., Lewis J., Johnson A. (2002). Molekularbiologie der Zelle . Girlandenwissenschaft. ISBN 978-0-8153-3218-3.